När antalet HIV- och aids-fall ökade världen över blev behovet av tillförlitliga HIV-tester avgörande. Idag används western blot-testet rutinmässigt för att bekräfta positiva resultat från ELISA-tester för HIV. Även borrelia (Lyme disease) diagnostiseras med hjälp av western blot-analys.
Testmetoden bygger på intrikata detektionstekniker: blodprover måste överföras från en gel till ett membran för att underlätta detektionsprocessen. För att faktiskt identifiera antikroppar i membranet använder laboratoriepersonal specifika enzymer, substrat och/eller fluoroforer. Nedan följer en genomgång av de vanligaste metoderna.
Alkaliskt fosfatas (AP) utgör ett av de främsta enzymerna vid western blot-testning. AP har en linjär reaktionstid, vilket ger det en detektionsfördel jämfört med andra enzymer. Ju längre tid en AP-reaktion får pågå, desto mer exakt blir testet. Den längre tidsperioden kan dock även fånga upp andra kemiska föreningar och så kallat bakgrundsbrus, vilket riskerar att snedvrida testresultaten.
Laboratoriepersonal anser ofta att horseradish peroxidase (HRP) är överlägset AP. Det beror på HRP:s mindre molekylstorlek, höga aktivitetsnivå, goda kompatibilitet med reaktionsmembranet, höga tillförlitlighet, låga pris och breda tillgänglighet på marknaden.
Kromogena substrat anses bäst lämpade för att visualisera reaktionen mellan blod och enzym inuti membranet. De är dock inte lika känsliga som andra typer av substrat och tenderar att blekna när blotet torkar. Trots detta utgör kromogena substrat ett effektivt val när man behöver en snabb, visuell bekräftelse av testresultatet.
Kemiluminescerande substrat kräver en kontinuerlig reaktion för att testet ska lyckas. Om enzymet upphör att vara aktivt eller om substratet tar slut går testresultatet förlorat. Under optimala förhållanden blir resultatet dock tillgängligt inom en till 24 timmar. Eftersom det mänskliga ögat inte kan uppfatta den kemiluminescerande signalen använder laboratoriepersonal digital bildutrustning eller röntgenfilmer för att dokumentera och analysera resultatet.
Om laboratoriepersonal inte arbetar med enzymer och deras respektive substrat använder de i stället antikroppar konjugerade med fluoroforer. Fluoroformetoden kräver färre arbetssteg, men däremot specialutrustning. Testet behöver en exciteringsljuskälla som utlöser rätt reaktion i membranet. Fluoroforer och motsvarande ljusutrustning är kostsamma, men fördelen är att flera olika fluoroforer kan användas samtidigt i samma experiment, vilket möjliggör multiplexanalys.
Val av detektionsmetod vid western blot beror på laboratoriets behov av känslighet, hastighet och budget. AP erbjuder hög noggrannhet över tid, HRP kombinerar prestanda med låg kostnad, kromogena substrat ger snabba visuella resultat, kemiluminescens levererar hög känslighet och fluoroforer möjliggör samtidig detektering av flera mål – albeit till en högre investeringskostnad.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online