Hydrolys av N-benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) av trypsin följer klassisk Michaelis-Menten-kinetik, vilket gör det till en standardanalys för serinproteasaktivitet.
Kinetiska faser
- Initial hastighet (V₀) fas: [S] >> Kₘ; hastigheten är konstant och proportionell mot [E]. Linjär produktbildning (p-nitroanilin frigörande mätt vid 410 nm).
- Övergångsfas: Substratkoncentration minskar; hastigheten saktar när enzymmättnaden minskar.
- Plato: Substrat utarmat; reaktionen närmar sig fullständighet.
Matematisk beskrivning
Integrerad Michaelis-Menten-ekvation för progresskurvan:
t = (Kₘ/Vₘₐₓ) ln([S]₀/[S]ₜ) + ([S]₀ - [S]ₜ)/Vₘₐₓ
Där [S]₀ = initial substratkoncentration, [S]ₜ = koncentration vid tid t.
Parameterbestämning
- Mät initiala hastigheter vid varierande [S]₀.
- Lineweaver-Burk (1/v vs 1/[S]), Hanes-Woolf ([S]/v vs [S]), eller Eadie-Hofstee (v vs v/[S]) plot ger Kₘ och Vₘₐₓ.
- kcat = Vₘₐₓ/[E]ₜ; katalytisk effektivitet = kcat/Kₘ.
Experimentella överväganden
- Standardvillkor: pH 8,0 (Tris-HCl), 37°C.
- Ca²⁺ stabiliserar trypsin; undvik chelatorer (EDTA).
- Inner filter-effekt vid hög [S] eller produktackumling – korrigera matematiskt eller förtunna prover.
Denna analys är grundläggande för enzymekärning, inhibitor-screening, och bioprocessövervakning.
