Så mäter du katalaskoncentrationer – steg för steg

Katalas är en biologisk (organisk) katalysator. Detta enzym är en av de mest potenta katalysatorer som är kända, har gynnsamma effekter på den mänskliga kroppen och är avgörande för livet. Katalas fungerar som en katalysator som påskyndar nedbrytningen av väteperoxid.

Väteperoxid är en metabolisk biprodukt som är giftig för cellerna om den inte avlägsnas. Katalas hjälper till att bryta ner väteperoxid till vatten och syre. Enzymet bidrar också till att oxidera andra gifter, exempelvis fenoler, myrsyra, formaldehyd och alkoholer.

Det här behöver du

• Två portioner à 110 ml kromogen i fosfatbuffert
• 300 µl substrat – 30 % väteperoxid
• 400 µl HRP – pepparrotsperoxidas i fosfatbuffert
• 60 ml fosfatbuffert
• 250 ml provspädningsmedel (tensid) i fosfatbuffert
• Två portioner à 30 ml substratspädare i fosfatbuffert
• Två portioner à 30 ml stoppreagens – natriumazid
• Två flaskor med standardkatalas, 160 U per flaska
• Spektrofotometer
• Justerbara pipetter på 10 µl
• Kyvetter för spektrofotometri med 1 cm optisk väglängd
• Mikrorör i polypropen på 1,5 ml med lock
• Provrör – 12 x 75 mm (2,5 ml vardera)
• Tidsur
• Avjoniserat vatten

Instruktioner

1. Förbered lagerlösningen av katalas som du ska mäta genom att tillsätta 200 mikroliter (µl) avjoniserat vatten till katalaskoncentrationen i en 50-millilitersflaska (ml). Katalaskoncentrationen ska vara 160 enheter per milliliter (U/ml).

2. Tillsätt 30 µl av den utspädda katalasen i rören. Tillsätt därefter 500 µl av substratet (väteperoxid – 10 mm H2O2) i varje rör. Var noga med att inte stänka väteperoxid när du arbetar med det.

3. Inkubera varje rör i en minut vid rumstemperatur.

4. Tillsätt 500 µl reagens i varje flaska. Sätt på locket och blanda genom att vända flaskan upp och ned flera gånger. Rör inte om blandningen, skaka inte flaskan och använd inget föremål för att röra om.

5. Tillsätt 20 µl av varje reaktionsblandning i provrören. Häll sedan 2 milliliter HRP-reagens i varje provrör. Blanda återigen lösningen genom att vända provrörena upp och ned flera gånger.

6. Inkubera lösningen igen, den här gången i 10 minuter vid rumstemperatur.

7. Läs av lösningens absorbansnivå med en spektrofotometer. Instrumentet mäter ljusvåglängder för att exakt bestämma vilka ämnen som finns i lösningen och i vilka koncentrationer. Den här metoden ger en tillförlitlig avläsning av katalaskoncentrationerna. Informationen är värdefull för att förstå samspelet mellan katalas och väteperoxid – både i det här experimentet och i de processer som sker naturligt i människokroppen.