Hoechst-färgämnen är fluorescerande färgämnen som används för att märka DNA och RNA med hjälp av fluorescensmikroskopi och flödescytometri. Hoechst 33258 och Hoechst 33342 är de mest använda varianterna av dessa färgämnen. De har förmågan att binda till DNA-molekyler, vilket gör att cellkärnor och mitokondrier framträder fluorescerande under ultraviolett ljus.
Protokoll för Hoechst-färgning är standardmetoder inom biotekniska laboratorier och genetiska laboratorier världen över. Nedan följer tre vanligt förekommande protokoll som täcker både cellfärgning med Hoechst 33258 och Hoechst 33342.
Detta protokoll används för att färga celler från musbenmärg. Tekniker bereder ett benmärgsprov med HBSS+-saltlösning, HEPES-buffer och fosterserum från kalv. Lösningen centrifugeras och tillsätts därefter till ett förvärmt DMEM-medium, varefter Hoechst-färgen adderas.
Lösningen placeras i ett vattenbad på 37 °C i exakt 90 minuter, enligt Institutionen för immunologi vid University of Pittsburgh. Efter färgningen framträder DNA-segmenten fluorescerande när provet analyseras i en cytometer, vilket möjliggör identifiering och rening av stamceller.
I detta protokoll suspenderas Hoechst 33342-färgen i destillerat vatten. Därefter tillsätts 2 procent fosterserum från kalv till cellprovet, samtidigt som pH-värdet hålls konstant vid 7,2 med hjälp av en bufferlösning.
Cellerna inkuberas sedan vid 37 °C i en timme och analyseras omedelbart därefter med ett instrument som kallas cytometer. Det färgade DNA:t blir då synligt och fluorescerande, enligt University of Michigan Health System.
Detta protokoll använder ett instrument som kallas spektrofotometer för att analysera DNA- och RNA-segment. Tekniker arbetar med en arbetslösning av Hoechst 33258 samt prover av kalvtymus-DNA.
Utöver detta bereds en separat lösning bestående av DNA-provet och ett kemiskt ämne som heter etidiumbromid. Färgningsresultaten från de två medierna jämförs därefter med hjälp av spektrofotometern, enligt Current Protocols in Cytometry. Denna metod ger en tillförlitlig kvantifiering av DNA-halten i provet.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online