NAD och NADH är båda pyridinnukleotider som spelar en central roll i ämnesomsättningen. De är koenzymer som finns i mitokondrierna – cellens kraftverk – och deltar i viktiga cellulära processer som cellandning och fotosyntes, där energi och väte genereras. Tillsammans driver NAD och NADH de biokemiska reaktioner som kräver flera olika enzymer för att producera ATP, cellens främsta energikälla.
Mätning av NADH och kvoten mellan NAD och NADH används ofta inom forskning för att bedöma cellers energistatus och metabola hälsa. Nedan följer en praktisk guide för hur analysen utförs i laboratoriemiljö.
Skölj cellerna eller vävnaden som ska studeras med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Extrahera cellerna eller finfördela vävnaden i extraktionsbuffert genom att placera blandningen på torris i 20 minuter och därefter i rumstemperatur i 10 minuter. Upprepa denna frysnings- och upptiningscykel.
Virvelmixa provet i 10 sekunder. Centrifugera i 5 minuter för att sedimentera cell- eller vävnadsrester. Avlägsna supernatanten, det vill säga den flytande fasen, och överför den till ett rent rör.
Filtrera supernatanten genom ett specialfilter för att avlägsna enzymer som annars kan bryta ned NADH och påverka resultatet.
Ta ut 200 mikroliter av provet, placera i ett rent rör och värm till 60 grader Celsius i ett värmeblock i 30 minuter för att denaturera NAD. Kyla därefter provet, centrifugera och avlägsna den flytande fasen. Överför 50 mikroliter till en 96-brunnsplatta; varje prov bör analyseras i dublett eller triplicat för tillförlitliga resultat. Observera att provet inte ska värmas om du vill bestämma total NAD (NADt).
Bered cykleringsblandningen enligt kitets anvisningar och tillsätt den till 96-brunnsplattan. Blanda och inkubera i 5 minuter. Tillsätt sedan 10 mikroliter utvecklarlösning och låt provet inkubera i rumstemperatur i upp till 4 timmar. Avsluta med stopplösning. Avläs färgändringen i en plattläsare eller fluorimeter, beroende på vilken typ av kit som används.
Bered en standardkurva genom att späda en känd koncentration av NADH i extraktionsbuffert. Skapa flera olika koncentrationer och se till att slutvolymen är densamma som för testproven. Pipettera standarderna på samma 96-brunnsplatta som testproven och avläs den optiska densiteten.
Rita standardkurvan med koncentrationen på x-axeln och den optiska densiteten på y-axeln. Beräkna medelvärdet för varje testprov och avläs motsvarande koncentration från standardkurvans diagram.
Beräkna slutligen kvoten NAD/NADH genom att subtrahera total NAD (NADt) från NADH-värdet och därefter dividera med NADH-värdet. Denna kvot ger en bild av cellens redoxbalans och metabola tillstånd.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online