Ammoniumklorid (NH₄Cl) lyser röda blodkroppar (RBC) via osmotisk lys, utnyttjar den unika permeabiliteten hos RBC-membranet för NH₃/NH₄⁺.
Mekanism
- NH₄Cl dissocierar: NH₄⁺ + Cl⁻.
- NH₃ (oladdad) diffunderar snabbt IN i RBC (hög permeabilitet).
- Inuti RBC (pH ~7,2): NH₃ + H⁺ → NH₄⁺ (fångas).
- Intracellulär [NH₄⁺] stiger → ↑ osmolaritet → vatteninflöde → svullnad → ruptur.
- Cl⁻ följer eller går in via anjonutbytare (AE1/Band 3).
Varför det är selektivt för RBC
- RBC saknar mitokondrier → inget urea-cykel för att detoxifiera NH₄⁺.
- Hög NH₃-permeabilitet (AQP1, RhAG-kanaler).
- Kärnbärande celler (Vita blodkroppar) metaboliserar NH₄⁺ via glutaminsyntetas; motståndskraftiga mot lys.
Standardprotokoll (ACK Lysningsbuffert)
- Sammansättning: 150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA, pH 7,2–7,4.
- Koncentration: ~0,8% NH₄Cl (8 g/L) – nära de 0,9% som citeras.
- Procedur: Tillsätt 1–5 mL buffert per 1 mL blod; inkubera 2–5 min vid RT; centrifugera; tvätta.
- Temperatur: Rumstemperatur optimalt; 4°C saktar lys.
Applikationer
- Lys RBC i helblod för vitblodkroppsanalys (flödescytometri, DNA/RNA-extraktion).
- Blodtypning (ta bort RBC-påverkan).
- Perifer blod mononukleära celler (PBMC) isolering (efter Ficoll).
- Benmärg / mjälte bearbetning.
Begränsningar & alternativ
- Kan skada vita blodkroppar om förlängt (>10 min) eller hög koncentration.
- Ej för funktionsanalyser som kräver intakta membran.
- Alternativ: Hypoton vatten (snabbare, hårdare), kommersiella RBC-lysningsbuffertar (t.ex. BD Pharm Lyse, eBioscience).
Säkerhet
- NH₄Cl är irritant; använd handskar, skyddsglasögon.
- Avverka enligt institutionellt kemiskt avfallsprotokoll.
