Hur man väljer begränsningsenzymer

Restriktionsenzymer är enzymer som skär både enkelt- och dubbelsträngat DNA. Varje restriktionsenzym har en specifik nukleotidsekvens som kallas en restriktionsplats som den känner igen och skär. Restriktionsenzymer används för DNA-sekvensering mutationsanalys och kloning och amplifiering av DNA. Forskare använder restriktionsenzymer för att införa gen av intresse i expressionsvektorer DNA-molekyler som kan replikera separat från kromosomalt DNA. Vektorn som innehåller genen av intresse kan sedan införas i en bakteriell stam för expression och karakterisering av proteiner.

Identifiera restriktionsenzymställen på din vektor genom att titta på en restriktionskarta. Begränsningskortet kommer att berätta vilka enzymer som kommer att skära din vektor och var.

Välj ett restriktionsenzym som också har en sida som är närvarande på din geninsats genom att titta på sekvensen av Föra in. Se till att restriktionsstället är i en position på din insats som ligger utanför genen av intresse så att du inte förlorar någon del av genen.

Se till att det inte finns några dubbleringar av restriktionsstället var som helst i din geninsats eller vektor. Detta kommer att orsaka flera nedskärningar i ditt DNA och ge dig vilseledande data.

Försök att välja restriktionsenzymer som skär med klibbiga ändar snarare än trubbiga ändar. Klibbiga ändar uppträder när enzymet skär dubbelsträngat DNA på ett förskjutet sätt vilket lämnar ett enkelsträngat överhäng som underlättar fastsättning med en insatsskärning på motsatt sätt. Stumma ändar uppstår när dubbelsträngat DNA skärs på ett jämnt sätt och dessa är svårare att fästa.

Välj ett annat restriktionsenzym i båda ändarna av din insats för att se till att det infogas i vektorn i rätt orientering och för att säkerställa att vektorn inte återfästes i sig.

Försök välja två restriktionsenzymer som fungerar bra i samma buffertsystem och temperatur . Om det inte är möjligt springa varje uppslutning separat.

Tips

Vissa webbprogram har utvecklats för att snabbt identifiera restriktionsställen på en DNA-sekvens. Ett sådant program är från New England BioLabs.

Saker som behövs

Sekvens för geninsats

Begränsningskarta för valfri vektor

Förteckning över restriktionsenzymer och deras snittplatser