Restriktionsenzymer – DNA-saxar
Skär enkel-/dubbelsträngat DNA vid specifik sekvens (restriktionsplats). Används: DNA-sekvensering, mutationsanalys, kloning, amplifying. Inför gen i expressionsvektor (replikerar separat från kromosom) → bakteriell stam för proteinuttryck/karakterisering.
Steg-för-steg-val
- Identifiera enzymställen på vektorn via restriktionskarta (vilka enzymer skär var).
- Välj enzym med plats på insatsen (insert) – platsen måste ligga utanför genen för att inte skada den.
- Kontrollera inga dubbletter i insats eller vektor – ger multipla skär, vilseledande data.
- Föredra "klibbiga ändar" (sticky ends) – skär förskjutet, ger enkelsträngat överhänge → enklare ligation. "Trubbiga ändar" (blunt ends) = jämn skärning, svårare att fästa.
- Använd olika enzymer i båda ändar av insatsen → rätt orientering, förhindrar vektor-självligation.
- Välj enzymer som fungerar i samma buffer/temperatur – annars kör separata reaktioner.
Tips och material
Webbverktyg (t.ex. New England BioLabs) för snabb identifikation av restriktionsställen. Behöver: geninsats-sekvens, vektors restriktionskarta, lista över enzymer/snittplatser.
