Molekylära kloningsprotokoll omfattar de förfaranden som används för att definiera, isolera och replikera en DNA-sekvens. Traditionella protokoll för restriktions- och ligationskloning inleds med fragmentering av DNA med hjälp av restriktionsendonukleaser (enzymer som klipper DNA-strängar vid specifika restriktionsställen), följt av ligering av DNA-fragment (reparation av diskontinuiteter i DNA-molekyler), transfektion (introduktion av nukleinsyra i en cell) samt selektion (urval av enskilda genomer för replikering).
Protokoll för isolering av ett DNA-fragment, det första steget i molekylär kloning, innefattar ofta en polymeraskedjereaktion (PCR), som använder cykler av uppvärmning och kylning för att amplifiera DNA-segment. För att uppnå önskad sekvenslängd inkluderar andra protokoll DNA-sonicering, nedbrytning med reaktionsenzymer samt användning av kemiskt syntetiserade oligonukleotider. Vilket protokoll som väljs beror på storlek och mängd av det isolerade DNA som krävs.
Ligeringsprotokoll bygger på användning av enzymet DNA-ligas, som sammanfogar DNA-molekyler med en kovalent bindning. Enligt standardprotokollet kombineras DNA-fragment, kloningsvektor, ligationsbuffert, DNA-ligas och sterilt vatten i ett mikrocentrifugrör, som därefter inkuberas över natten vid 4 grader Celsius.
Transfektionsprotokoll, det vill säga metoder för att föra in DNA i en cell utan virala vektorer, innebär ofta att DNA injiceras direkt i cellens cytoplasma. Andra metoder använder kemiska reagens, såsom kalciumfosfat och lipider, för att transportera transfektionskomplexet genom cellmembranet. Denna teknik används för att undersöka hur genmodifieringar påverkar funktionen hos specifika gener.
Selektions- eller screeningsprotokoll avgör vilka celler som framgångsrikt har tagit upp DNA-inserten och visar vilka celler som behöver isoleras. En centrifug skördar celler som innehåller det transfekterade DNA:t, vilka därefter inkuberas i en lysozymbuffert (lysozym är ett naturligt förekommande enzym) och behandlas med ett alkaliskt rengöringsmedel för att göra proteiner och membran lösliga.
Proteinerna fälls ut med acetat, varefter en centrifug och ostduk separerar det DNA-haltiga supernatanten, alltså den lösliga vätska som återstår efter centrifugering. Supernatanten fälls sedan ut med polyetylenglykol, centrifugeras och suspenderas i en buffert bestående av cesiumklorid och etidiumbromid. Etidiumbromidet färgar DNA:t efter densitet, och med hjälp av långvågigt UV-ljus kan den lägre bandet av DNA extraheras med en 5 ml-spruta.
En ekilibrerad jonbyteskolonn separerar därefter DNA:t från etidiumbromid och cesiumklorid. Det slutliga DNA-pelleten suspenderas i en buffertlösning och verifieras slutligen med agaroosgelelektrofores.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online