Molecular Cloning Protokoll

Molekylära kloningsprotokollomfattar de förfaranden som används för att definiera , isolera och replikering av en DNA-sekvens . Traditionella restriktions och ligering kloningsprotokollinitiera DNA-fragmentering med begränsade endonukleaser (enzymer som skär DNA-strängarna vid restriktionsställen ), DNA-fragment ligering ( reparation av diskontinuiteter i DNA-molekyler ) , transfektion ( införande av nukleinsyra in i en cellkropp ) och urval ( det val av enskilda genomen för replikering ) . Isolering

Protokoll för isolering av ett DNA-fragment , det första steget i molekylär kloning , som ofta innehåller en polymeras-kedjereaktion (PMR) , som använder cykler av uppvärmning och kylning för att amplifiera delar av DNA . För att nå målet sekvens storlek , andra protokoll inkluderar DNA ultraljudsbehandling , reaktionsenzymnedbrytningoch användning av kemiskt syntetiserade oligonukleotider . Dessa protokoll variera beroende på storleken och mängden av isolerad DNA behövs.

Ligeringsprodukter

Protokoll för ligering involverar användning av ett enzym , DNA-ligas , för att ansluta sig DNA-molekyler tillsammans med en kovalent bindning. Protokoll dikterar att kombinera DNA-fragment , kloningsvektom , en ligeringsbuffert , DNA- ligas och steriliserat vatten i ett mikrocentrifugrör och inkubera över natten vid 4 grader Celsius .
Transfektion

protokoll för transfektion , eller infusion av DNA i en cell genom att använda en icke - virala medel , innebär ofta att injicera DNA direkt in i cellens cytoplasma . Andra metoder inkluderar användning av kemiska reagens , såsom kalciumfosfat och lipider, för att leverera den transfektion komplex genom cellmembranet . Denna metod testar effekterna av genmodifiering för funktionen av specifika gener .
Selection

Selection , eller sållning , protokoll avgöra vilka celler som hölls framgångsrikt DNA- insatsen och ange vilka celler behöver isolering. En centrifug skördar celler som innehåller det transfekterade DNA: t, som sedan inkuberades i en lysozym ( ett naturligt förekommande enzym) -buffert och behandlas med ett alkaliskt rengöringsmedel , som ger de proteiner och membraner löslighet. Med hjälp av acetat för att fälla ut proteiner , en centrifug och cheesecloth välja DNA -innehållande supernatant ( den lösliga vätska kvar från en centrifug förening ) . Supernatanten fälldes ut med polyetylenglykol , centrifugerades och suspenderades i en cesiumklorid och etidiumbromid -buffert. Den etidiumbromid fläckar DNA enligt densitet, och med användning av en långvågig UV-ljus, är lägre band DNA extraheras med ett cc spruta fem . En jämviktad jonbytarkolonn separerar DNA från etidiumbromid och cesiumklorid , och den slutliga DNA-pelleten suspenderas i en buffertlösning och detekteras på agarosgelelektrofores. Addera